Una vez que las células aparecen separadas, agregue 2 volúmenes de medio de crecimiento completo precalentado para inactivar la tripsina. Disperse suavemente el medio pipeteando sobre la superficie de la capa celular varias veces para asegurar la recuperación del >95 % de las células.
¿Cómo detengo la actividad de la tripsina?
La digestión de la tripsina puede detenerse congelando o bajando el pH de la reacción por debajo de pH 4 mediante la adición de ácido fórmico, acético o trifluoroacético (la tripsina recuperará su actividad cuando la el pH se eleva por encima de pH 4). Las muestras digeridas se pueden almacenar a -20 °C.
¿Qué neutraliza la tripsina?
Un tampón que contenga iones de calcio y magnesio también ralentizará la actividad de la tripsina. Sin embargo, FBS es la forma más eficaz de inhibir la actividad de la tripsina.
¿El suero inactiva la tripsina?
El suero inactiva la tripsina residual que queda de la digestión enzimática de los riñones y las enzimas proteolíticas sintetizadas posteriormente por las células. Las células recién tratadas con tripsina se pueden cultivar en monocapas en ausencia de suero, siempre que se laven repetidamente para eliminar la tripsina residual.
¿Cuántos medios se necesitan para desactivar la tripsina?
Siempre que utilice una proporción de al menos 1:1 de medio que contenga suero al 5-10 % con la tripsina, debería haber una inhibición más que suficiente, seguida de centrifugación e intercambio medio con medio fresco.
